Ларри Дэйли, бывший ночной сторож Музея естественной истории в Нью-Йорке, сталкивается с критической проблемой: древняя золотая пластина, оживляющая экспонаты, начинает разрушаться. Без неё его необычные друзья — от иероглифов до доисторических существ — навсегда превратятся в бездушные музейные предметы.
Ларри, ставший уже бывалым охранником Музея Естественной истории, снова оказывается в центре невероятных событий. После очередного переезда коллекции все ожившие экспонаты — от смешного скелета динозавра до философствующего Теодора Рузвельта — переносятся в грандиозные залы Смитсоновского института.
Ларри, неудачливый искатель работы, наконец-то находит место ночного сторожа в огромном музее естественной истории. Он мечтает о спокойной службе, но вскоре обнаруживает, что его смена будет самой неспокойной в жизни. Согласно древнему правилу, все экспонаты оживают с наступлением темноты, и главная задача Ларри — не допустить, чтобы они покинули стены музея.